Plateau immunomonitoring chez l’homme

Le plateau d’immunomonitoring chez l’homme (IMP) de l’Institut Toulousain des Maladies Infectieuses et Inflammatoires (INFINITy, Inserm UMR1291 – CNRS UMR5051 – Université Toulouse II) est spécialisé dans le stockage et l’analyse des cellules immunitaires humaines

Notre équipe

Supervision du plateau : Raphaëlle ROMIEU-MOUREZ (PhD, raphaelle.romieu-mourez@inserm.fr)

Gestion des biobanques : Pierre Emmanuel PAULET (pierre-emmanuel-paulet@inserm.fr)

Responsable scientifique : Roland LIBLAU (MD PhD, roland.liblau@inserm.fr)

 
Pour prendre contact avec le plateau, écrire à imp.infinity@inserm.fr ou appeler au +33 5 62 74 86 66
Comité de pilotage
Claire CENAC (Eq. J-C. Guéry)
Nathalie JONCA (Eq. M. Simon)
Emmanuel TREINER (Eq. A. Saoudi / R. Liblau)
Xavier IRIART (Eq. N. Blanchard)
Florence ABRAVANEL (Eq. J. Izopet / B. Lagane)
Claire DETRAVES (Eq. J. van Meerwijk / O. Joffre)
Nicolas FAZILLEAU (Eq. N. Fazilleau / S. Guerder)
Loïc DUPRE (Eq. R. Lesourne / L. Dupré)
Laurent GUILLEMINAULT (Eq. L. Reber)

Activités

BIOBANKING DE PBMC Y COMPRIS EN SITUATION CLINIQUE ET SUR ÉCHANTILLONS FRAGILES

BIOBANKING DE TISSUS LYMPHOÎDES

CONTRÔLES DE QUALITÉ ASSOCIÉS AU BIOBANKING

COMPTAGE AUTOMATISÉ DE PBMC FRAIS ET CRYOPRÉSERVÉS (CELLOMETER AUTO2000, BT20, CYTOMETRIE)

IMMUNOMONITORING PHENOTYPIQUE ET FONCTIONNEL SUR COHORTES CLINIQUES

CYTOMETRIE

ELISPOT

TECHNOLOGIE MESO SCALE DISCOVERY POUR DOSAGE DE BIOMARQUEURS

LIEN AVEC INSTITUTIONS POUR SUIVI RÉGLEMENTAIRE DE LA RECHERCHE SUR LA PERSONNE HUMAINE

Fonctionnement

Nos prestations se déclinent sous forme de mise à disposition de biobanques, de services et de formations en biobanking et immunomonitoring chez l’homme dans nos locaux ou ceux de l’équipe demandeuse.

Nos locaux techniques et nos procédures permettent la manipulation d’échantillons humains dans diverses situations cliniques, y compris en pathologie infectieuse.

Pour des raisons réglementaires, nos biobanques sont réservées aux équipes d’INFINITy après l’accord par le comité de pilotage et la soumission d’un formulaire de commande PBMC request_Infinity.

Les autres prestations sont accessibles à toute équipe de recherche publique ou privée. La définition d’une prestation est ouverte et non pas “à la carte”, en fonction des besoins de l’équipe demandeuse. Une continuité peut s’établir entre l’équipe et le plateau par le biais de formations et d’interventions espacées.

Les prestations offertes par le plateau sont détaillées ci dessous sur cette page et les demandes de prestation peuvent être adressées au plateau imp.infinity@inserm.fr

Prestations : biobanques, immunomonitoring et formations

Mise à disposition de biobanques de PBMC, plasma, ADN et tissus lymphoïdes de sujets sains

PBMC, plasma, ADN de sujets sains

  • Les PBMC sont isolés de couches leuco-plaquettaires provenant de dons de sang auprès de l’Établissement Français du Sang (EFS) en Occitanie.
  • Les donneurs sont des volontaires adultes ayant fait un don de sang pour un usage thérapeutique en suivant la procédure mise en place par l’EFS. Les donneurs ont été jugés aptes à donner leur sang par un médecin de l’EFS. Chaque don est contrôlé pour l’absence de contre-indication permanente concernant les infections connues pour être transmissibles par le sang (hépatites virales, syphilis, infection par le VIH ou le HTLV).
  • Le plateau met à disposition des ampoules congelées contenant chacune au minimum 15 millions de PBMC. Les plasma et l’ADN sont également conservés pour des analyses moléculaires.
  • Entre 500 et 2000 ampoules sont utilisées chaque année pour des recherches sur l’homme par les équipes d’INFINITy. Environ 100 donneurs sont ajoutés à la banque annuellement afin d’obtenir un stock constant de PBMC provenant de plus de 350 personnes depuis 2015.
  • Les contrôles de qualité effectués annuellement sur les PBMC cryopréservés sont la mesure de la viabilité à la décongélation, le comptage des cellules T CD4+ et CD8+ et l’analyse de la production d’interféron-gamma par les cellules T CD8+ mémoires.
  • Les PBMC sont caractérisés pour l’âge, le sexe, le groupe sanguin, le typage HLA-A2 et HLA-B7, la sérologie CMV et la sérologie toxoplasmose des donneurs.

 

Tissus lymphoïdes de sujets sains

  • Une des collaborations scientifiques entre l’Inserm et le CHU de Toulouse est axée sur l’étude de tissus lymphoïdes pédiatriques, dont les fonctions et la composition cellulaire se distinguent du sang périphérique. Les tissus analysés sont des déchets opératoires d’amygdales et de thymus pédiatriques obtenus avec l’accord des familles informées de la recherche.
  • Le plateau supervise le transfert des échantillons et leur suivi réglementaire dans le cadre des études au sein d’INFINITy
Immunomonitoring phénotypique et fonctionnel sur échantillons cliniques

Nous effectuons de l’Immunomonitoring phénotypique et fonctionnel, y compris longitudinal, sur des échantillons de patients pris en charge dans les Centres Hospitaliers Universitaires de France.

Les prélèvements nous parviennent frais ou cryopréservés. A titre d’exemple, les analyses peuvent inclure : analyse fonctionnelle de la réponse Th, immuno-phénotypage standardisé en lien avec le plateau de cytométrie d’INFINITy, analyses ELISPOT standardisées, optimisation du biobanking et des paramètres de congélation…

Les études se réalisent classiquement en 2 phases.

  • 1ere phase du projet : mise au point et validation des protocoles, souvent en s’appuyant sur la biobanque de sujets sains
  • 2eme phase du projet : réalisation en routine des protocoles sur les cohortes cliniques ciblées

Des prélèvements d’enfants asthmatiques suivis au CHU de Toulouse, de patients atteints d’une infection par le virus de l’hépatite E, de patients hospitalisés à la suite d’une infection par le virus Sars-CoV-2 et de patients atteints de narcolepsie ont été ainsi étudiés par le plateau.

La durée de ces analyses est par essence variable, allant de quelques semaines à plusieurs mois avec au besoin une transmission des protocoles et savoir-faire aux équipes demandeuses.

Veille technologique en biobanking et en immunomonitoring

Nous transmettons nos approches en biobanking ou immunomonitoring pour soutenir des recherches sur des cohortes cliniques.

Nous participons à l’étude de nouvelles techniques et à l’évaluation des variations intra- et inter-expérimentales, à savoir entre les expérimentateurs et au cours du temps.

Des exemples incluent :

  • Contrôles de qualité de biobanques de PBMC potentiellement fragiles (ex : échantillons transportés depuis d’autres régions de France, patients avec certaines pathologies pouvant affecter les cellules sanguines)
  • Isolement de PBMC d’échantillons sanguins de faible volume en vue d’études pédiatriques
  • Test de kits d’isolement de PBMC en comparaison avec les méthodologies classiques par Ficoll
  • Comparaison de méthodes automatisées de comptage de PBMC frais ou cryopréservés
  • Standardisation des analyses ELISPOT
  • ELISPOT ex vivo sur PBMC frais en comparaison sur des PBMC cryopréservés
  • Mise au point de profil cytométriques multiparamériques en lien avec le plateau cytométrie d’INFINITy
simple et double ELISPOT - simple et double FLUOROSPOT

Test ELISPOT sur les PBMC d’un patient hospitalisé au CHU de Toulouse

La technologie et lecteur ELISPOT sont utilisés en routine sur le plateau dans le cadre d’études fondamentales ou cliniques, notamment en coordination avec le CHU de Toulouse. Ces analyses se sont insérées dans le suivi de la réponse effectrice mémoire spécifique du virus de l’hépatite E, l’évaluation de l’efficacité des vaccins ARN ciblant Sars-CoV-2 chez des personnes en immuno-suppression, le ciblage de peptides antigéniques potentiels, l’analyse de la production d’anticorps.

Nous disposons d’un lecteur ELISPOT S6 Ultra-V analyzer de Cellular Technology Ltd :

  • Permet la lecture d’ELISPOT simples et doubles. Les substrats sont classiquement le BCIP/NBT (bleu) et/ou AEC (rouge). Les cellules formant les spots apparaitront bleues, rouges ou violet foncé, en fonction de leur marquage simple ou double
  • Permet la lecture de Fluorospot simples et doubles. Les filtres sont FITC (verts) et/ou PE (rouge). Les cellules formant les spots fluoresceront en vert, rouge ou jaune, en fonction de leur marquage simple ou double
  • S’adapte à toutes les plaques ELISPOT de 96 puits

 

La conception et la réalisation des analyses ELISPOT et l’utilisation du lecteur sont offerts par le plateau en service et en formation.

Quick Plex SQ120 pour le dosage de biomarqueurs (Meso Scale Discovery)

                Le Quick Plex SQ120 permet le dosage de biomarqueurs avec une technologie basée sur l’électrochimiluminescence développée par la société Meso Scale Discovery. Le site https://www.mesoscale.com/ liste les centaines de quantifications possibles chez l’homme, les primates et les rongeurs et qui sont toutes adaptées au Quick Plex SQ120

 

  • Les analyses utilisent plusieurs types de kits (R-plex, U-plex, T-plex, V-plex, S-plex) qui offrent tous une excellente linéarité (5-log) et certains la possibilité de multiplexage (ex U-plex allant jusqu’à 10-plex)
  • Les limites inférieures de détection des U-plex se situent en général autour du picogramme/mL. Les S-plex, mesurant 1 seul analyte, offrent le gain d’une sensibilité augmentée avec des les limites inférieures de détection de l’ordre du femtogramme/mL
  • Les analyses peuvent porter sur des substrats biologiques divers tels que plasma, sérum, surnageant cellulaire, broyat de tissus, liquide céphalorachidien….
  • Les dosages se réalisent sur plaques 96 puits complètes ou partielles avec moins de 25microL de substrat par dosage en simplicate ou duplicate

La conception et la réalisation des dosages de biomarqueurs avec la technologie Meso Scale Discovery et l’utilisation du lecteur Quick Plex SQ120 sont offerts par le plateau en service et en formation.

Affaires réglementaires liées à la recherche sur la personne humaine

Nous facilitons le lien avec les spécialistes chargés des affaires réglementaires de différentes tutelles (e.g. CHU, Inserm) afin d’assurer le respect du cadre éthique et légal de la recherche sur la personne humaine et de faciliter les démarches administratives incombant aux équipes de recherche. Ces démarches sont faites pour des équipes individuelles tout comme pour INFINITy dans sa globalité.

Des exemples de notre activité incluent la rédaction de notices d’information de patients mineurs et majeurs et de consentement éclairé à des études cliniques, déclaration de collections d’échantillons biologiques humains auprès du MESR et du Comité de protection des personnes, organisation éthique, contractuelle et administrative de recherches portant sur des déchets opératoires du CHU.

Liens utiles pour comprendre la législation relative à la recherche sur la personne humaine en France :

Facturation

Équipes d’INFINITy

  • Le prix de mise à disposition des ampoules de PBMC (au moins 15 million de cellules) est 11 euros HT l’unité
  • Les prestations de service en biobanking et immunomonitoring sont facturées pour couvrir les frais avancés par le plateau (le plus souvent en plastiques consommables, réactifs, cytométrie et prestations hospitalières) avec une majoration de 10%
  • L’utilisation du lecteur ELISPOT et du lecteur Quick Plex SQ120 Meso Scale Discovery n’est pas facturée
  • Les formations ne sont pas facturées

 

Équipes externes publiques de recherche

  • Les biobanques ne sont pas cédées pour des raisons réglementaires
  • Lecture ELISPOT : 25 eurosHT/plaque en libre service et 50 euros HT/plaque lorsque réalisé par le plateau (sans compter les frais d’expédition des plaques)
  • Lecture Quick Plex SQ120 Meso Scale Discovery : 40 euros HT/plaque
  • Un devis est réalisé pour les autres prestations, service en biobanking et immunomonitoring et formation

 

Équipes externes privées de recherche

  • Les biobanques ne sont pas cédées pour des raisons réglementaires
  • Lecture ELISPOT : 71 euros HT/plaque en libre service et 96 euros HT/plaque lorsque réalisé par le plateau (sans compter les frais d’expédition des plaques)
  • Lecture Quick Plex SQ120 Meso Scale Discovery : 50 euros HT/plaque
  • Un devis est réalisé pour les autres prestations, service en biobanking et immunomonitoring et formation
  •  

Contact, formulaires et réservation

– Afin d’accéder aux biobanques, il suffit de nous envoyer par courriel au moins 1 semaine à l’avance le formulaire de demande d’ampoules PBMC request_Infinity.

– La réservation du Quick Plex SQ120 Meso Scale Discovery (formation obligatoire) se fait en ligne https://www.infinity.inserm.fr/reservations/ (section “Appareils”), en indiquant si vous souhaitez emprunter l’agitateur thermostaté.

– Les autres équipements sont accessibles sans réservation.

Autres informations

Publications

Healthy subject PBMC, plasma, DNA and lymphoid tissue biobanks

– Effector memory CD8 T cell response elicits Hepatitis E Virus genotype 3 pathogenesis in the elderly El Costa H, Gouilly J, Abravanel F, Bahraoui E, Peron J-M, Kamar N, Jabrane-Ferrat N, Izopet J PLoS Pathog. 2021 Feb; 17(2): e1009367

– Circulating follicular helper T cells exhibit reduced ICOS expression and impaired function in narcolepsy type 1 patients. Nguyen XH, Dauvilliers Y, Quériault C, Perals C, Romieu-Mourez R, Paulet PE, Bernard-Valnet R, Fazilleau N, Liblau R. J Autoimmun. 2018 Nov;94:134-142.

 

Immune-Monitoring on clinical cohorts and assay development

– Conventional and innate lymphocytes response at the acute phase of HEV infection in transplanted patients. Abravanel F, Barragué H, Dörr G, Sauné K, Péron JM, Alric L, Kamar N, Izopet J, Champagne E.J Infect. 2016 Jun;72(6):723-730.

Protocoles et manuels techniques

Les documents sont disponibles sur requête à imp.infinity@inserm.fr

PBMC isolation and cryopreservation

PBMC thawing

Fresh versus frozen PBMC counting (BT20 counter, Cellometer auto2000 counting, cytometry)

ELISPOT technology to numerate effector memory T cells

Booklet “ELISPOT reader”

Booklet “Introduction to Meso Scale Discovery technology and Quick Plex SQ120 reader for the dosage of biomarkers”

Inserm

Inserm

CNRS

CNRS

UT3

UT3